Proponente del progetto: Mario Capasso, nato a Napoli, il 07/04/1977

Titolo: PhD

Istituto: CEINGE Biotecnologie Avanzate, Via G. Salvatore, 486 (già Via Comunale Margherita) 80145-Napoli

email: capasso@ceinge.unina.it

Tel:+39 081 3737898

Durata del progetto: 3 anni

Costo complessivo del progetto: 145.000,00 euro

RIASSUNTO

Questo progetto si propone due obbiettivi principali:

– valutare il ruolo funzionale delle già note varianti genetiche di rischio del gene BARD1 nella predisposizione all’insorgenza del neuroblastoma;
– trovare nuove alterazioni genetiche a livello costituzionale e somatico dello stesso gene associate al neuroblastoma.
Questa ricerca è progettata per identificare i fattori genetici che hanno un impatto sul neuroblastoma e che quindi permetteranno una migliore valutazione del rischio di malattia e del decorso clinico. Le conoscenze ottenute da questi studi daranno un forte contributo alla comprensione della patogenesi del neuroblastoma e dei fattori che influenzano la severità della malattia e potranno avere, inoltre, implicazioni sia nello screening che nell’identificazione di pathway critici per i targets terapeutici.

Il proponente di questo progetto è stato lui stesso coinvolto in uno studio genetico che per la prima volta ha dimostrato che alcuni polimorfismi genetici di BARD1 sono fattori di rischio per l’insorgenza e progressione del neuroblastoma (Capasso et al., Nat Genet 2009; 4:718-723); infatti, durante un periodo di formazione al Children’s Hospital of Philadelphia (USA) ha avuto un ruolo principale nella scoperta di varianti genetiche del gene onco-soppressore BARD1 dimostrando che portatori di particolari polimorfismi avevano un rischio aumentato di sviluppare un tipo di neuroblastoma molto grave detto “high-risk”.

Recentemente abbiamo individuato un altro gene (LMO1, cromosoma 11p15.4) che presenta alterazioni genetiche che sono fattori rischio per l’insorgenza del neuroblastoma (Wang K et al., Nature 2010, In press)

Questo progetto si basa su un’importante collaborazione tra il Prof. Achille Iolascon, il proponente del progetto e il gruppo del Dr John Maris e Dr Marcella Devoto del Children’s Hospital of Philadelphia che ci ha permesso di ottenere un importante insieme di dati derivanti dalla caratterizzazione di circa 500.000 varianti genetiche (SNPs) del DNA costituzionale effettuata mediante un’innovativa tecnologia (SNP array) su una grande popolazione di soggetti con neuroblastoma (2705) e soggetti sani (5580) e che ci consentirà di effettuare ulteriori analisi statistiche utili sia alla caratterizzazione del ruolo di BARD1 nello sviluppo del neuroblastoma sia a identificare nuovi fattori di rischio di altri geni.

La ricerca sarà effettuata presso l’istituto CEINGE Biotecnologie Avanzate (Napoli) nel laboratorio del Prof. Achille Iolascon in cui sono presenti le attrezzature necessarie per svolgere tutte le analisi previste dal progetto. Il progetto avrà una durata di tre anni, come descritto nel diagramma sotto, e si prevede un costo totale del progetto di 145.000 euro. Una quota sarà utilizzata per stipulare un contratto di una borsa di studio, un’altra per comprare i reagenti necessari alla realizzazione degli esperimenti mentre una quota minore sarà dedicata alle spese per partecipazione a convegni, riunioni di lavoro e produzione di pubblicazioni.

BASE DI PARTENZA SCIENTIFICA

Nonostante evidenti miglioramenti nella cura di molti tumori infantili, il neuroblastoma rimane un importante problema clinico; infatti, esso provoca il 15% di tutte le morti oncologiche pediatriche (Maris et al., 2007) e circa la metà dei pazienti con neuroblastoma presenta una malattia debolmente diffusa che è spesso resistente a chemioterapie intensive. La cura è efficace solo per meno del 40% dei pazienti high-risk. Le aberrazioni genetiche acquisite sono di fondamentale importanza per predire il fenotipo del tumore nei pazienti con neuroblastoma (Maris et al., 2007). I tumori con amplificazioni dell’oncogene MYCN, le delezioni del cromosoma 1p, 11q, o entrambi tipicamente sono metastatici alla diagnosi e resistenti alla terapia (Attiyeh et al., 2005). Invece, i tumori che non mostrano aberrazioni cromosomiali ma iperdiploidia dovuta ad aumenti dell’intero cromosoma sono più facilmente curabili e possono anche regredire spontaneamente (George et al., 2005). Nonostante l’ampia conoscenza delle aberrazioni genomiche che correlano con i fenotipi tumorali, poco è conosciuto circa gli eventi che predispongono allo sviluppo del neuroblastoma. Studi epidemiologici non hanno identificato nessuna comune esposizione ambientale che possa influenzare la suscettibilità al neuroblastoma (Olshan et al., 1999_1 e 1999_2). D’altra parte studi genetici di ereditarietà della malattia hanno dimostrato che ALK è il principale gene di predisposizione al neuroblastoma familiare (Mossé et al., 2008; Janoueix-Lerosey et al., 2008).

Riarrangiamenti cromosomici costituzionali sono stati riscontrati in pazienti con neuroblastoma, questi comprendevano anche delezioni di loci, supposti essere onco-soppressivi, nel cromosoma 1p36 e nella banda 11q14-23 (Stage et al., 2003; Mossé et al., 2003; Biegel et al., 1993) La predisposizione al neuroblastoma è, dunque, geneticamente eterogenea, e l’insorgenza del tumore potrebbe aver bisogno di più alterazioni. Nel loro insieme, la molteplicità dei possibili eventi di innesco della malattia suggerisce che il neuroblastoma è una malattia genetica complessa in cui l’interazione degli effetti di differenti alterazioni genetiche potrebbe essere necessaria per la tumorogenesi.

Negli ultimi due anni il proponente di questo progetto di ricerca ha partecipato attivamente ad uno studio svoltosi al Children’s Hospital of Philadelphia (USA) dove è stato dimostrato che varianti comuni del DNA predispongono a trasformazioni maligne neuroblastiche. Abbiamo dimostrato che tre SNPs intronici localizzati nel gene predetto FLJ22536 (cromosoma 6p22) sono fortemente associati allo sviluppo del neuroblastoma sporadico e al suo decorso non favorevole (Maris et al., 2008). Inoltre, utilizzando un disegno sperimentale che prevedeva il confronto delle frequenze alleliche tra solo i casi con neuroblastoma aggressivo (high-risk) contro tutti i controlli sani, siamo stati in grado di dimostrare che il gene onco-soppressore BARD1 è nuovo gene di suscettibilità al neuroblastoma con caratteristiche severe (Capasso et al., 2009). Infatti, SNPs comuni di cui sei intronici, tre non-sinonimi e uno localizzato in una regione di regolazione del gene erano fortemente associati al neuroblastoma di tipo high-risk. Infine, molto di recente, abbiamo individuato un altro gene (LMO1) le cui anomalie strutturali lo rendono un importante oncogene coinvolto nello sviluppo del neuroblstoma (Wang K et al., Nature 2010, In press).

Queste risultati suggeriscono che esiste un modello di tipo “variante comune, malattia comune” per il neuroblastoma (cioè l’interazione di variazioni genetiche multiple nello sviluppo del neuroblasta può predisporre allo sviluppo della malattia).

La motivazione della proposta di questo progetto deriva dalla scarsità dell’informazioni circa la tumorogenesi e progressione del neuroblastoma e quindi dal bisogno di svelare nuove alterazioni genetiche e genomiche coinvolte nella suscettibilità a tale malattia.

Noi proponiamo di definire la funzione dei polimorfismi di BARD1 stabilendo come essi potrebbero influenzare l’espressione del gene e di cercare nuove alterazioni genetiche costituzionali o somatiche (tipo polimorfismi, mutazioni o delezioni) che potrebbero modificare le funzioni onco-soppressive di BARD1 e far parte, quindi, di quella molteplicità di eventi che contribuiscono allo sviluppo e progressione del tumore.

I risultati di questo progetto permetteranno di svelare una parte della rete di meccanismi biologici e biochimici che sono alla base di questa devastante malattia e che in futuro potranno essere i bersagli di nuove terapie individualizzate che tengono conto non solo delle caratteristiche cliniche del paziente ma anche di quelle genomiche e genetiche.

DESCRIZIONE DELLA RICERCA

Il neuroblastoma è una malattia complessa dovuta dall’interazione di diverse alterazioni genetiche con un effetto relativamente basso o moderato sull’inizio della trasformazione delle cellule normali in quelle tumorali e sulla progressione del tumore. Abbiamo già dimostrato che alcuni SNPs del gene onco-soppressore BARD1 sono associati con lo sviluppo e progressione del neuroblastoma (Capasso et al. 2009). Qui proponiamo di svelare le funzioni di questi polimorfismi mediante studi in vitro e scoprire nuovi fattori di rischio genetico sia a livello somatico che costituzionale mediante sequenziamento del gene BARD1. Per raggiungere questi due obiettivi la ricerca sarà divisa in tre fasi per una durata complessiva di 3 anni.

Fase 1

Replicare l’associazione genetica tra i polimorfismi di BARD1 e neuroblastoma in casi e controlli con origine italiana. Ottenibile in 6 mesi

In questa fase realizzeremo uno studio di associazione genetica per dimostrare che gli SNPs trovati associati con il neuroblastoma nella popolazione di origine americana (USA) della nostra precedente ricerca risultano essere fattori di rischio anche in soggetti di origine italiana. Confronteremo quindi le frequenze alleliche di cinque SNPs tra 200 soggetti affetti da neuroblastoma (detti casi) e 500 soggetti sani detti (controlli). L’associazione è definita come la constatazione di un aumento della frequenza allelica nei casi rispetto ai controlli.

Metodi

Per questa analisi genetica saranno analizzati i due SNPs intronici rs3768716 e rs17487792 che risultavano essere, nel precedente studio (Capasso et al., Nat Genet 2009; 4:718-723), i più significativamente associati alla malattia, più i tre non-sinomini SNPs rs1048108, rs2229571 e rs2070094 che erano invece i più significativi tra quelli esonici.

Utilizzeremo campioni di DNA da sangue di 380 pazienti con neuroblastoma e di 800 controlli sani già presenti nella Banca di DNA di questo Istituto (CEINGE Biotecnologie Avanzate). Il reclutamento di casi e controlli è correntemente in atto, quindi la grandezza dello nostro campione è in crescita. Tutti gli individui inclusi in questa fase dello studio di associazione hanno origine italiana. La genotipizzazione degli SNPs verrà effettuata mediante metodo TaqMan o digestione enzimatica. Le frequenze alleliche saranno stimate in ogni locus, le frequenze genotipiche saranno testate per Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) mediante il test del chi-quadrato. I marcatori che deviano significativamente dall’HWE dopo correzione per multipli test saranno rimossi dalle successive analisi. Effettueremo i test di associazione per gli alleli e genotipi di ogni SNP utilizzando il test chi-quadrato. Calcoleremo gli odds ratio che stimano il rischio dei genotipi e alleli di ogni SNPs.

Risultati Preliminari

Nell’anno 2010 abbiamo già genotipizzato cinque SNPs localizzati nel gene BARD1 (Tabella 1) utilizzando il DNA costituzionale proveniente da circa 200 pazienti con neuroblastoma e 500 soggetti sani. Le analisi di associazione genetica mostravano che quattro su cinque SNPs risultavano significativamente associati all’insorgenza del neuroblastoma. Questi dati rappresentano un ulteriore conferma che fattori rischio genetico del gene BARD1 sono fortemente coinvolti nella suscettibilità allo sviluppo del neuroblastoma

Le analisi di genotipizzazione saranno estese ad circa  nuovi 170 pazienti con neuroblastoma e 300 soggetti sani.

Fase 2

Caratterizzare la funzione degli SNPs non-sinonimi di BARD1. Ottenibile in un anno

Un’analisi di predizione bioinformatica della funzione degli  SNPs di BARD1 è stata già svolta. Queste analisi hanno identificato lo SNP rs1048108 come quello che ha una maggiore probabilità di alterare le funzioni di BARD1. Questo SNP potrebbe alterare lo splicing del gene e quindi essere il motivo della creazione di differenti forme del gene. E’ stato già dimostrato che esistono differenti isoforme di BARD1 e una di questa è stata associata a tumori aggressivi dell’ovaio (Li L et al., 2007).

Metodi

Per valutare se un particolare genotipo del suddetto SNP influenza lo splicing alterantivo di BARD1 utilizzeremo la metodica “allele-specific real time PCR” su circa 30 linee linfoblastoidi derivati dal sangue di soggetti sani. Lo stesso verrà fatto anche per l’altro SNP esonico (rs222957).

Fase 3

Identificazione di nuovi fattori di rischio nelle regioni genomiche di BARD1 più significativamente associate al neuroblastoma Ottenibile in un anno

Nel nostro precedente lavoro più di uno SNPs risultava essere associato al neuroblastoma. In particolare, gli SNPs intronici rs3768716 e rs17487792 erano tra quelli più significativi. In questa fase, sequenzieremo le regioni genomiche indentificate da queste due varianti sia su campioni di DNA somatico che germinale, nell’intento di scoprire nuove alterazioni genetiche quali polimorfismi, mutazioni o delezioni che potrebbero essere fattori di rischio del neuroblastoma.

Metodi

Per questa analisi verranno utilizzati circa 30 campioni di DNA estratto da tessuto tumorale e da sangue di soggetti affetti da neuroblastoma già presenti nela Banca di DNA di questo Istituto (CEINGE Biotecnologie Avanzate). Ulteriori 20 campioni di DNA estratto da sangue di soggetti sani saranno utilizzati come controlli. Le regioni genomiche da sequenziare verrano selezionate mediante l’analisi degli aplotipi, utilizzando il software Haploview. Per le analisi di sequenziamento utilizzeremo il sequenziatore automatico presente in questo Istituto.

Il restante periodo di sei mesi verrà dedicato alla fase di  pubblicazioni degli eventuali  risultati ottenuti da questo progetto di ricerca

RISULTATI ATTESI

Noi crediamo che, mediante la rigorosa programmazione di questo progetto, otterremo risultati che potranno fornire nuove conoscenze su i meccanismi eziologici e di progressione del neuroblastoma. L’identificazione di nuovi fattori genetici potrà dare un forte contributo nella classificazione dei tumori e valutazione del rischio di progressione della malattia. Questo potrà essere utile nella scelta del miglior trattamento terapeutico da applicare. Infine, le alterazioni genetiche trovate potranno essere nuovi targets per metodi terapeutici alternativi.

*COSTO COMPLESSIVO DELLA RICERCA

Totale richiesto: 145.000 euro

Durata del progetto: 3 anni

Anno I

Contratto per una borsa di un biotecnologo 20.000

Reagenti: 20.000

Costi viaggi e meeting: 5.000

Anno II

Contratto per una borsa di un biotecnologo 20.000

Reagenti: 25.000

Costi viaggi e meeting: 5.000

Anno III

Contratto per una borsa di un biotecnologo 20.000

Reagenti: 25.000

Costi viaggi e meeting: 3.000

Costi per pubblicazioni: 2.000

PUBBLICAZIONI del Proponente del progetto

Wang K, Zhang H, Hou C, Diskin SJ, Attiyeh EF, Diamond M, Bosse K, Winter C, Glessner J, Kim C, Frackelton E, Garris M, Wang Q, Glaberson W, Chiavacci R, Nguyen L,. Grant SF, Mosse Y, Iolascon A, Hannenhalli S, Li H, Devoto M, McGrady PW, London WB, Capasso M, Rahman N, Hakonarson H & Maris J. Integrative genomics identifies LMO1 as a neuroblastoma oncogene. Nature, 2010 In press.
Russo R, Capasso M, Paolucci P, Iolascon A; Pediatric pharmacogenetic and pharmacogenomic studies: the current state and future perspectives TEDDY European Network of Excellence. Eur J Clin Pharmacol. 2010 Nov 11. In Press
Capasso M, Ayala F, Avvisati RA, Russo R, Gambale A, Mozzillo N, Ascierto PA, Iolascon A MDM2 SNP309 and p53 Arg72Pro in cutaneous melanoma: association between SNP309 GG genotype and tumor Breslow thickness. J Hum Genet. 2010; 55:518-24.
Capasso M, Diskin SJ. Genetics and genomics of neuroblastoma. Cancer Treat Res. 2010;155:65-84. Review.
Spano D, Russo R, Di Maso V, Rosso N, Terracciano LM, Roncalli M, Tornillo L, Capasso M, Tiribelli C, Iolascon A. Galectin-1 and its involvement in Hepatocellular Carcinoma aggressiveness Mol Med. 2010; 16:102-15.
Capasso M, Devoto M, Hou C, Asgharzadeh S, Glessner Jt, Attiyeh Ef, Mosse Yp, Cecilia Kim C, Diskin Sj, Cole Ka, Bosse K, Diamond M, Laudenslager M, Winter C, Bradfield Jp, Scott Rh, Jagannathan J, Garris M, Mcconville C, London Wb, Seeger Rc, Grant Sfa, Li H, Rahman N, Rappaport E, Hakonarson H Maris Jm. Common variations in BARD1 influences susceptibility to high-risk neuroblastoma Nature Genetics, 2009; 41:718-723.
Maris JM, Mosse YP, Bradfield JP, Hou C, Monni S, Scott R, Asgharzadeh S, Attiyeh EF, Diskin SJ, Laudenslager M, Winter C, Glessner JT, Kim C, Frackelton EC, Casalunovo T, Eckert AW, Capasso M, Rappaport EF, McConville C, London WB, Seeger RC, Rahman N, Devoto M, Grant SFA, Li H & Hakonarson H. Chromosome 6p22 locus associated with clinically aggressive neuroblastoma. N Engl J Med 2008; 358:2585-93.
Capasso M, Ayala F, Russo R, Avvisati RA, Asci R, Iolascon A. A predicted functional single-nucleotide polymorphism of bone morphogenetic protein-4 gene affects mRNA expression and shows a significant association with cutaneous melanoma in Southern Italian population. J Cancer Res Clin Oncol. 2009 135:1799-807.
Elia J, Capasso M, Ambrosini P, Berrettini W, Devoto M, Hakonarson H. Candidate Gene Analysis in an On-going Genome-Wide Association Study of ADHD: Suggestive Association Signals in ADRA1A. Psychiatric Genetics, 2009; 19:134-41.
Spano D, Cimmino F, Capasso M, D’Angelo F, Zambrano N, Terracciano L, Iolascon A Changes of the hepatic proteome in hepatitis B-infected mouse model at early stages of fibrosis. J Proteome Res. 2008; 7:2642-53.
Cimmino F, Spano D, Capasso M, Zambrano N, Russo R, Zollo M and Iolascon A. Comparative proteomic expression profile in all-trans-retinoic-acid-differentiated neuroblastoma cell line. J  Proteome Res. 2007; 6:2550-64.
Capasso M, Avvisati R, Piscopo C, Laforgia N, Raimondi F, De Angelis F, Iolascon A. Cytokine gene polymorphisms in Italian preterm infants: association between Interleukin-10 –1082 G/A polymorphism and respiratory distress syndrome. Pediatric Research 2007; 6:313-317.
Persico M *, Capasso M *, Russo R, Persico E, Croce` L, Tiribelli C, Iolascon A. Elevated expression and polymorphisms of SOCS3 influence patient response to antiviral therapy in chronic hepatitis C. Gut 2008; 57:507-15 (*These authors contributed equally to the study).
Persico M *, Capasso M *, Persico E, Svelto M, Russo R, Spano D, Crocè L, La Mura V, Moschella F, Masutti F, Tiribelli C, Iolascon A. SOCS3 expression and hepatitis C virus genotype 1b infection: association with clinical expression of insulin resistance and non-response to antiviral therapy. Hepatology 2007; 46:1009-15 (*These authors contributed equally to the study).
Persico M, Capasso M, Persico E, Masarone M, de Renzo A, Spano D, Bruno S and Iolascon A Interleukin-10 –1082 GG polymorphism influences the occurrence and the clinical characteristics of hepatitis c virus  infection. Journal of Hepatology 2006; 45:779-85.
Persico M, Russo R, Persico E, Svelto M, Spano D, Andolfo I, La Mura V, Capasso M, Tiribelli C, Torella R, Iolascon A. SOCS3 and IRS-1 gene expression differs between genotype 1 and genotype 2 hepatitis C virus-infected HepG2 cells. Clin Chem Lab Med. 2009; 47:1217-25.
Barone M, Spano D, D’Apolito M, Centra M, Lasalandra C, Capasso M, Di Leo A, Volinia S, Arcelli D, Rosso N, Francavilla A, Tiribelli C, Iolascon A. Gene expression analysis in HBV transgenic mouse liver: a model to study early events related to hepatocarcinogenesis. Mol Med. 2006;12:115-23.
Svahn J, Capasso M, Lanciotti M, Marrone A, Haupt R, Bacigalupo A, Pongiglione C,  Boschetto L, Longoni D, Pillon M,  Pistorio A, Di Michele P, Iori AP, Calvillo M, Locasciulli A, Menna G, Riccardi R, Ramenghi U, Dufour C, Iolascon A The polymorphisms -318C>T in the promoter and 49A>G in exon 1 of CTLA4 and the risk of aplastic anemia in a Caucasian population. Bone Marrow Transplant. 2005;35 Suppl 1:S89-92.
Dofour C, Capasso M, Svahn J, Marrone A, Haupt R, Bacigalupo A, Giordani L, Longoni D, Pillon M, Pistorio A, Di Michele P, Iori A P, Pungiglione C, Panciotti M, Iolascon A. Homozygosis for (12) CA repeats in the first intron of the human INF-γ gene is significantly associated with the risk of aplastic anemia in Caucasian population. Br J Haematol 2004; 126:682-685.
Del Vecchio A, Laforgia N, Capasso M, Iolascon A, Latini G. The role of molecular genetics in the pathogenesis and diagnosis of neonatal sepsis. Clin Perinatol 2004; 31:53-67.